協(xié)議目標(biāo)
該協(xié)議的目的是提供使用 INKREDIBLE 、INKREDIBLE+ 或 BIO X 的 CELLINK? LAMININK 系列進行生物打印的說明，并涵蓋從預(yù)打印與細胞混合、3D 生物打印和離子交聯(lián)的打印后過程的步驟。 CELLINK? LAMININK 系列包括 CELLINK? LAMININK111 、 CELLINK? LAMININK 121 、 CELLINK? LAMININK 411 、 CELLINK? LAMININK 521 和 CELLINK? LAMININK+。 該方案針對 CELLINK? LAMININK 進行了優(yōu)化，未稀釋以及使用 10+1 細胞懸液稀釋。 更改協(xié)議中的參數(shù)可能會更改所需的交聯(lián)時間。 該協(xié)議使用BIO X 的氣動打印頭進行了優(yōu)化。1
所需材料
Cellink?層板*
清除墨盒，3cC*
無菌錐形生物打印噴嘴*
BioX*或InkRedible-系列*3D Bioprinter
孔板或培養(yǎng)皿
交聯(lián)劑（包括在bioink采購中）
細胞+細胞培養(yǎng)基
3毫升帶luer鎖連接的注射器
陰/陰路厄鎖適配器*或細胞混合器*
*該產(chǎn)品可在innovate-m.com購買
協(xié)議
本協(xié)議可在室溫下使用打印頭和打印機執(zhí)行，室溫在20-25°C之間。
| 步驟 | 標(biāo)題 | 材料 | 說明 |
| 1 | 準(zhǔn)備生物墨水 | — CELLINK? LAMININK | 如果不使用細胞打印，則直接轉(zhuǎn)到第 3 步。
– 將 CELLINK? LAMININK 墨盒加熱至室溫。 |
| 2 | 將
CELLINK ?LAMINI NK 與細胞混合 |
–?帶魯爾鎖接頭的 3?ml?注射器
–?預(yù)熱的CELLINK? SKIN –?母/母魯爾鎖接頭 – 注射器中的細胞懸浮液 |
此時，將十份 bioink 與一份細胞懸浮液混合，注意不要將氣泡引入混合物中。有關(guān)詳細說明，請參閱Mixing Cells Protocol CELLINK 系列。
–?使用母/母魯爾鎖接頭將細胞懸液轉(zhuǎn)移到 1?ml?細胞注射器（第 1?部分）。 –?使用母/母魯爾鎖適配器將 bioink?轉(zhuǎn)移到 12?毫升注射器（第 2?部分）。 –?將兩個注射器夾在分配裝置上（第 3?部分）。 –?將兩個注射器連接到混合裝置（第 4?部分），然后將空墨盒（第 5?部分）連接到混合裝置的另一側(cè)。 –?輕輕按壓分配裝置，將兩個注射器的內(nèi)容物混合到空墨盒中。 注意：為避免在混合 bioink 和細胞懸液時出現(xiàn)氣隙，請在將注射器與細胞懸液連接之前小心地用CELLINK? LAMININK 預(yù)填充 Luer Lock 適配器。如果準(zhǔn)備的 CELLINK? LAMININK 數(shù)量小于 2 毫升，建議連接兩個 3 毫升魯爾鎖注射器并在注射器之間來回混合直至均勻。 |
| 3 | 冷卻并裝入墨盒 | –?透明墨盒，裝有 CELLINK? LAMININK（和
電池）的 3cc –?無菌錐形生物打印噴嘴。 |
– 將經(jīng)過室溫處理的 CELLINK? LAMININK 放入帶有所選打印噴嘴的打印頭和蓋子中。 推薦的噴嘴尺寸為 22G。 降低噴嘴直徑以實現(xiàn)更小的燈絲直徑，但這也會增加 bioink 堵塞的風(fēng)險。 |
| 4 | 打印 | – 生物打印機
（推薦 BIO X |
– 生物打印結(jié)構(gòu)的參數(shù)根據(jù)表 1 或應(yīng)用說明中的打印參數(shù)。 如果打印性不符合要求，將壓力向上 /向下調(diào)整 1 kPa 以擠出更多/更少的材料。 注意：如果在兩次擠壓之間等待時間過長，生物墨水可能會在噴嘴中變干，從而導(dǎo)致噴嘴堵塞。 如果發(fā)生這種情況，請更換新的噴嘴。 |
| 或
INKREDIBLE 系列） – 孔板或培養(yǎng) |
|||
| 皿 |
表1.建議的最小擠壓壓力*(±2 kPa）用于在21-25°C下打印連續(xù)長絲，有單元/無單元。同樣，“有細胞”假設(shè)一份細胞懸浮液和十份生物墨水的混合物。有關(guān)燈絲直徑的信息，請參見應(yīng)用筆記中的打印參數(shù)。對于高度濃縮的細胞懸浮液，壓力需要增加到用于未稀釋生物墨水的壓力。
*注意，這只是推薦的起始壓力參考。 所需的實際壓力將根據(jù)制備程序（生物墨水的量和生物墨水的實際溫度）以及活塞在墨盒中的安裝和打印表面的平整度而有所不同。 該表是在打印頭溫度為 22°C 時“無細胞”和 27°C“有細胞”以及使用低濃度細胞的bioink 稀釋生成的。
| 步驟 | 標(biāo)題 | 材料 | 說明 |
| 5 | 交聯(lián) | 交聯(lián)液
細胞培養(yǎng)基 |
CELLINK? LAMININK 可以使用 CaCl2 交聯(lián)溶液與離子交聯(lián)。 |
| – 根據(jù)構(gòu)建體的大小，將載有細胞的構(gòu)建體浸入 | |||
| 交聯(lián)溶液中 30 秒至 5 分鐘。 去除交聯(lián)溶液并 | |||
| 用基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖洗一次構(gòu)建體。 | |||
| 6 | 孵化 | -細胞培養(yǎng)基 | 交聯(lián)和洗滌后，將所需培養(yǎng)基添加到構(gòu)建體
中并放入孵化器。 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件（37°C、5% CO2 和 95% 相對濕度）或根據(jù)您的應(yīng)用在細胞培養(yǎng)基中孵育構(gòu)建體。 |
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