該協議的目的是提供使用 INKREDIBLE、INKREDIBLE+、BIO?X?或 BIO?X6?的 GelXA LAMININK?生物墨水進行生物打印的說明，有無細胞。 GelXA?LAMININK?系列包括GelXA?LAMININK?111?、GelXA?LAMININK?121?、GelXA?LAMININK?411?、GelXALAMININK?521?和 GelXA?LAMININK+。 本文件涵蓋了與細胞的預打印混合、3D?生物打印和離子交聯或通過光固化的后打印過程。 該方案針對 GelXA?LAMININK?進行了優化，其中 LAP?0.25%?未稀釋以及 10+1?細胞懸液稀釋。 改變LAP?或 bioink?的濃度與細胞懸浮液的比例會改變光交聯時間。 參考光交聯優化協議來調整和確定這些數字。?該協議通過使 BIO?X?和?BIO?X6?的溫控打印頭進行了優化。
如果從橙色防紫外線墨盒轉印，請保持生物墨水不受光影響，以避免在打印前交聯。在黑暗模式下使用3D打印機。光引發劑對反復或長時間暴露于熱敏感。
使用BIO X或BIO X6，在15°C下冷卻打印床，在24°C下溫控打印頭時，該協議工作最佳。GelXA層狀油墨也可以使用氣動打印頭或可噴墨系列進行擠壓，但如果環境溫度超過25°C且打印頭發熱，則形狀保真度會降低。如果使用可噴墨系列，打印基材如培養皿或孔板應放置在冰上或另一個冷卻的表面上，以便在打印后熱凝膠結構，然后再進行光交聯。
| 步驟 | 標題 | 材料 | 說明 |
| 1 | 準備生物墨水 | – GelXA LAMININK | 如果不使用單元格打印，則直接轉到第 3 步。
– 在墨盒/注射器中加熱 GelXA LAMININK |
| 在 37°C 下保持 10 分鐘。 GelXA LAMININK 的加熱可以在氣動打印頭、水浴或培養箱中進行。 長時間和重
復加熱會對光引發劑的穩定性和生物墨水的均勻性產 |
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| 生負面影響，需要在添加細胞之前進行額外的混合。如果不在墨盒中使用整個 3 mL 的 bioink，請使用女性
/女性 Luer 鎖適配器將所需的量轉移到注射器中，并在最佳存儲條件下保留其余的 bioink。 |
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| 注意：如果 bioink 中有氣泡，請在 1600 rpm 下快速離心 1.5 分鐘。 | |||
| 2 | 將 GelXA LAMININ
K 與細胞混合 |
–?細胞懸液 –?細胞混合器 –?母/母魯爾鎖適配器 –?帶 Luer?鎖連 接 的 3 mL?注射器 –?預熱的GelXA LAMININK |
此時，將十份bioink?與一份細胞懸液混合，注意不要將氣泡引入混合物中。有關詳細說明，請參閱Mixing?Cells?Protocol GelX?系列。 –?使用母/母Luer?鎖適配器將細胞懸浮液轉移到 1?mL?細胞注射器（第1?部分）。 –?使用母/母Luer?鎖接頭將GelXA?LAMININK?轉移到 12?mL?注射器（第2?部分）。 –?將兩個注射器夾在分配裝置上（第3?部分）。 –?將兩個注射器連接到混合裝置（第4?部分），然后將空藥筒（第5?部分）從另一側連接到混合裝置。 –?在分配裝置上輕輕施加壓力，將兩個注射器的內容物混合到空藥筒中。 注意：為避免在混合bioink 和細胞懸浮液時出現氣隙，請在將注射器與細胞懸浮液連接之前小心地用 GelXA LAMININK 預填充Luer 鎖適配器。 如果準備 <2?mL?的 GelXA?LAMININK，建議連接兩個 3?mL 魯爾鎖注射器，并在注射器之間來回混合bioink，直到它變得均勻。 |
| 3 | 冷卻并裝入墨盒 |
–?紫外線屏蔽子彈,3CC?裝入格爾克薩 層壓 （ 及 細胞） –?無菌錐形生物打印 噴嘴, 22- 27g |
–?將墨盒放置在%1的計數器上0-20分鐘到觸角 房間 溫度。 如果 這個 生物墨水 有 被預熱后, 它 罐頭 取而代之的是 是 放置 在 a?冰箱對于 3-5分鐘，或在溫度控制下 打印頭 在24°C 對于 5?分鐘數 對于 更快 冷卻。 注： 房間 溫度 是 在內部 20-25°C。 –?將室溫回火的GelXA層狀油墨放入 打印頭和帶有打印噴嘴的帽。如果 使用 這個 生物X?或生物 X6， 預冷這個打印床至 15°C。 |
| 注意：使用GelXA LAMININK打印時， 推薦 打印頭 溫度 對于 這個最高 打印 保真度 是 20- 25°C， 雖然 這個生物墨水 罐頭 是 分配 向上
至 32°C。 |
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| 4 | 打印 |
–?生物穿孔結構與參數 根據 至表1。如果打印適性不理想，請調整壓力上升/下降1?kPa以擠出更多/更少 材料。 –?如果打印頭在長時間打印過程中發熱 會議或環境溫度超過25°C， 生物墨水也會加熱到25°C以上 粘度降低，當擠出時觀察到 即使在低壓下也有很厚的細絲。在這里面凱斯, 重復 臺階 3?至 返回 至 這個 溫度范圍 對于 好打印適性。
注意：如果擠壓間隔時間過長 生物墨水 罐頭 干的 在 這個 噴嘴 造成 它 至 木屐。 如果 這個發生, 替換 與 新建 噴嘴。 |
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| – 生物穿孔器
（BIO X、BIO X6或 可墨水 |
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| 系列） | |||
| –? 板材 或
Petri 碟子 |
表1.使用稀釋/未稀釋生物油墨在20-25°C下打印連續長絲的建議最小擠壓壓力**(±2 kPa）?！跋♂尅奔僭O一份PBS到十份bioink的混合物，這是對bioink和細胞懸浮液混合條件的模擬。對于較小的稀釋度，壓力需要增加到用于未稀釋生物墨水的壓力。
| 步驟 | 標題 | 材料 | 說明 |
| 5 | 交聯 |
–?交聯劑和/或 –?用于光固化的405 或 365 nm 光模塊 –?細胞培養基 |
GelXA層狀油墨可以使用以下方法進行光交聯 這個 405 或 365 納米 光 模塊 或 離子地用CaCl交聯2-含交聯 探員。 如果 使用 兩者都有, 開始 與 光交聯。光交聯 僅限 威爾 生成 a 較硬 結果比 離子型 交聯 只有。
–?光交聯： 參見 表 2?下面 對于 推薦交聯時間。確保 生物打印GelXA層狀連接構建體是在打印后通過冷卻 打印床（如果使用BIO?X 或BIO?X6)或 放置 這個 打印 基材 與 這個在冰上構造10秒（如果使用 可噴墨系列）。如果光交聯過程中 生物打印, 設置 這個 交聯參數適當地 在 這個 G碼 對于 這個 可噴墨系列或打印頭設置頁面 對于 這個 生物 X?或 生物 X6.
注意：建議使用405納米光模塊 取而代之的是的 365 納米 一個 如果 有可能。 過度曝光 可能損壞 這個 細胞。
注： 至 驗證 這個 交聯 是 足夠, 添加 37°C 媒體至 一個 打印 嗯 而且 觀察 那個它 不 溶解。 –?離子型 交聯： 淹沒 這個 充滿細胞的交聯溶液中的結構物30?秒到5分鐘，具體取決于結構 大小。除去交聯液并沖洗 構造 與 基礎的文化 媒體 一次。 |
表2.建議的構建光交聯時間***。使用BIO X或BIO X6光固化模塊將每個光模塊的距離設置為5厘米。如果使用可噴墨系列光固化模塊，所需時間可能會減少。用其他參數交聯，見光交聯優化協議。該表是使用GelXA LAMININK與間充質干細胞生成的。使用細胞打印時，曝光時間不要超過120秒。為了在打印較厚的構造時達到最佳的結構完整性，建議每隔4層用365/405nm光施加3/5秒的光交聯。若在25°C以上使用bioink，每隔一層用365/405nm的光進行3/5s的光交聯，效果最好。
| 365牛米，搭接
0.25% |
405牛米，搭接
0.25% |
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| 施工深度(mm)/時間(s) | 1/5 | 1/10 |
| 3/20 | 3/30 |
***這只是一個推薦的參考交聯時間開始。交聯所需的實際時間將根據結構物的尺寸和溫度以及光固化模塊的強度和到結構物的距離而變化。
| 臺階 | 標題 | 材料 | 說明 |
| 6 | 孵化 | -細胞培養基 |
–?交聯后，將所需介質加入構造 而且 地點 他們在 一個 孵化器。 –?在細胞培養基中孵育構建物 標準培養條件 (37°C，5%CO2而且95% 相對的 濕度） 或根據 至 應用程序。 |
